A Espectroscopia no Infravermelho Próximo, ou NIR (Near-Infrared Spectroscopy, na sigla em inglês), é uma das mais versáteis e promissoras ferramentas do setor agrícola. Seu emprego tem auxiliado a caracterizar material genético de caju, analisar compostos de plantas medicinais e até agilizar a seleção de frutas, aprimorando o controle de qualidade. Todas essas aplicações feitas com velocidade muito maior do que os métodos convencionais.
Uma pessoa bem treinada consegue selecionar uma fruta por segundo, em um centro de embalagem e distribuição de frutas. Utilizando a NIR, é possível ampliar a produtividade de seleção para mais de 50 frutas por segundo.
As frutas seguem em uma esteira e passam pelo aparelho, que capta comprimento de onda e a intensidade da absorção de luz infravermelha. Os resultados são estimados por meio dos espectros captados. De acordo com modelos matemáticos e parâmetros previamente estabelecidos que associam as respostas obtidas a atributos de qualidade, as frutas são rapidamente selecionadas e separadas para diferentes destinações. O método permite a determinação simultânea de vários atributos de qualidade, tais como doçura, acidez, vitaminas, firmeza e, até, compostos funcionais
“Estudos realizados com aplicação de NIR em frutas mostram que se consegue selecionar 70, 80 até 100 frutas por segundo”, diz o pesquisador Ebenezer Silva, da Embrapa Agroindústria Tropical (CE), responsável por estudos que utilizam a técnica para melhorar o controle de qualidade em diversas aplicações agroindustriais.
Silva explica que a técnica tem sido usada na chamada “Indústria 4.0”, ou quarta revolução industrial, para realizar o controle de qualidade em tempo real. As aplicações estão cada vez mais próximas dos consumidores. Existem estudos para embarcar a tecnologia em smartphones. Assim, usando equipamentos NIR do tamanho de um chip, associado ao Big Data armazenado na nuvem, o consumidor poderá selecionar, com uma foto, as melhores frutas em uma gôndola de supermercado. Será possível saber, por exemplo, quão doce e suculento está um melão.
O NIR é capaz de realizar análises de forma rápida, sem destruir as amostras, eliminando a necessidade de realização de testes laboratoriais sofisticados e caros. O pesquisador esclarece, ainda, que é importante investir no desenvolvimento de modelos de calibração, já que esses protocolos podem custar caro. “A tecnologia é cara se vai buscar modelos de fora, porque os modelos são patenteáveis”, salienta.
Método facilita organização de material genético de cajueiro
A técnica NIR está em uso desde 2015 para acelerar a organização do Banco Ativo de Germoplasma do Cajueiro (BAG Caju) da Embrapa, que reúne os exemplares de plantas utilizados no Programa de Melhoramento Genético do Cajueiro. A expectativa é reduzir drasticamente os custos e o tempo de caracterização do banco, bem como facilitar futuras pesquisas com novos usos da planta.
“Seria uma forma de turbinar a caracterização do banco, de investigar aspectos de interesse de cada acesso, mesmo quando só temos uma árvore”, diz a pesquisadora Ana Cecília Ribeiro de Castro, coordenadora do BAG Caju.
O trabalho começou com a construção de um banco de espectros dos pseudofrutos e castanhas. Depois, os pesquisadores correlacionaram o banco de espectros com os dados obtidos em laboratório para determinadas características de interesse. No futuro, a caracterização de acessos do BAG Caju poderá dispensar a necessidade de realização de demorados e dispendiosos testes de bancada nos laboratórios.
“Podemos caracterizar o banco só com a captura dos espectros. Isso leva um tempo, mas é infinitamente mais rápido e ordenado do que analisar fruto a fruto no Laboratório de Pós-colheita”, explica a pesquisadora Ana Cecília Castro. “Quanto mais dados eu tenho, mais fácil será a utilização do acervo para outros fins. Seja a aplicação direta na química, seja para o melhoramento genético. Por isso, a caracterização é uma atividade contínua, que se aprimora com ferramentas analíticas como NIR”, detalha a pesquisadora.
Análise de planta medicinal sem usar reagentes
Outro estudo com NIR realizado na Embrapa resultou em um método para identificar diferentes quimiotipos de macela-da-terra (Egletes viscosa), planta da família do girassol que possui propriedades farmacológicas. O aparelho capta os espectros de luz infravermelha de um pequeno punhado de inflorescências e identifica características da amostra. O procedimento dura poucos minutos e não usa reagentes.
Silva acredita que o modelo desenvolvido para macela-da-terra pode, no futuro, passar por ajustes para utilização na indústria. “É útil para controlar algumas características ou compostos de interesse em alta velocidade e com alta precisão”, afirma.
No caso da macela-da-terra, a composição química do óleo essencial, que é uma característica intrínseca para cada quimiotipo, pôde ser determinada indiretamente por meio de modelos matemáticos aplicados aos espectros de infravermelho de suas inflorescências. No método convencional, seria necessário extrair o óleo, um processo que demora de três a quatro horas, e em seguida analisá-lo em um equipamento de bancada (cromatógrafo gasoso com espectrômetro de massas), processo que poderia demorar mais de uma hora.
Por enquanto, o modelo desenvolvido para macela-da-terra está em uso no laboratório para seleção de material utilizado em um projeto que estuda o potencial da planta para tratamento de problemas gastrintestinais. Mas o protocolo também poderá ser aplicado, futuramente, na indústria para o controle de qualidade da matéria-prima.
O projeto, em curso no Laboratório Multiusuário de Química de Produtos Naturais em Fortaleza (CE), deve avaliar a atividade gastroprotetora dos dois quimiotipos (exemplares que apresentam características químicas diferentes). Pretende, ainda, desenvolver métodos de autenticação botânica dos diferentes tipos da planta para avaliar qual o mais eficiente. “Uma vez que eles realmente apresentem diferença significativa em atividade biológica, será necessário um método que permita a seleção e o controle de qualidade”, explica o pesquisador Kirley Canuto.
O pesquisador acredita que esse tipo de teste rápido é útil para o controle de qualidade na indústria de processamento de plantas aromáticas e medicinais. “Uma mesma planta pode ter diversos quimiotipos, que muitas vezes não são identificáveis a olho nu”, explica o pesquisador. “Por esse motivo, são necessários métodos para garantir que aquele produto contém o quimiotipo que apresente o conjunto de substâncias ativas”, explica.
Estudos com a espécie Spodoptera frugiperda, a lagarta-do-cartucho, detectaram uma das proteínas Bt encontradas em cultivares transgênicas de milho – a Cry1F – nos ovos dos seus descendentes. Assim, antes mesmo que as lagartas eclodam, os embriões já podem ter sido expostos à proteína se a geração anterior se alimentou do milho Bt. Essa proteína é tóxica ao inseto, no entanto, com sua presença desde a fase de ovos, pode aumentar as chances de selecionar indivíduos resistentes.
“Descobrimos que a exposição da principal praga do milho a uma das proteínas Bt já começa no embrião, o que pode contribuir para a pressão de seleção da resistência”, explica a pesquisadora Simone Martins Mendes, da área de Entomologia da Embrapa Milho e Sorgo (MG). A descoberta, inédita e publicada em setembro na revista científica americanaPlos One, pode indicar novos caminhos para entender a rápida seleção da resistência dessa praga às tecnologias transgênicas.
“Em outro trabalho, [publicado em 2016 na revista científica europeiaEntomologia Experimentais et Applicata] mostramos que, em quatro gerações de seleção em laboratório, é possível selecionar lagartas resistentes a essa mesma proteína”, reitera a pesquisadora. “Na verdade, temos acompanhado a velocidade da seleção da resistência dessa espécie de praga às proteínas do Bt expressas no milho transgênico nas condições tropicais de cultivo. Já entendemos que muitos são os fatores que podem contribuir para esse quadro”, adianta Simone Mendes.
O artigo publicado na Plos One não é o primeiro trabalho científico que mostra o processo de transmissão da proteína Bt para os ovos de insetos. A pesquisadora Debora Pires Paula, da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (DF), detectou anteriormente a proteína Cry1Ac nos ovos de outro lepidóptero, o inseto Chlosyne lacinia, popularmente conhecido como lagarta-do-girassol, após o consumo da proteína pelos parentais, e também em ovos da joaninha predadora Harmonia axyridis. “Contudo, a Spodoptera frugiperda é a principal espécie-alvo da tecnologia Bt no milho que apresentou quebra de resistência à tecnologia para populações coletadas em 2012”, relata a cientista.
O mecanismo de resistência
De acordo com a engenheira agrônoma Camila Souza, autora do estudo que foi tema de dissertação de mestrado no programa de pós-graduação em Entomologia na Universidade Federal de Lavras (Ufla), a resistência a pragas é um dos principais efeitos indesejáveis da expressão de genes cry em culturas Bt e é considerada uma das principais ameaças ao uso sustentável das tecnologias transgênicas.
“As implicações que os processos de transferência da proteína Bt podem ter na evolução da resistência a insetos e até mesmo em organismos não alvo, como nos inimigos naturais, permanecem desconhecidas. Todavia, precisam ser investigadas, pois esses resultados mostram que os organismos não alvo podem ter acesso à proteína tóxica não somente por via direta, por meio de uma presa exposta à proteína, mas também indiretamente, pelos descendentes que ainda não tiveram contato por meio da ingestão da proteína”, demonstra.
A resistência pode ser caracterizada quando uma população de um inseto deixa de ser controlada pela toxina presente na planta transgênica e consegue sobreviver durante todo o ciclo, alimentando-se dessa planta e se reproduzindo. “Naturalmente existem indivíduos nas populações da praga que sobrevivem às proteínas do Bt. Porém, em condições normais, ou seja, sem a exposição constante às plantas transgênicas, a frequência com que esses indivíduos ocorrem é baixa. O processo de seleção da resistência nada mais é que o aumento da frequência de ocorrência desses insetos na população”, explica a pesquisadora Simone Mendes. “No caso do presente estudo, observamos que existe o sequestro da proteína Cry1F da planta Bt para a prole descendente, sendo que essa proteína é transferida dos pais para os ovos”, conclui.
Segundo a autora do estudo, a agrônoma Camila Souza, a alimentação de lagartas com folhas de milho contendo a proteína Cry1F, mesmo que apenas por cinco dias, de acordo com a metodologia utilizada, propiciou o sequestro e a transferência da proteína Bt das plantas para a geração seguinte. “A detecção da proteína Cry1F nos ovos de Spodoptera frugiperda, depois da exposição dos pais à proteína tóxica, confirma que as larvas são capazes de sequestrar a proteína presente nas folhas de milho e transferi-la para a sua prole. Em condições de campo, essa exposição pode ocorrer durante todo o ciclo de desenvolvimento do inseto. Por isso, são necessários estudos para entender todas essas interações no processo de seleção da resistência”, complementa a engenheira-agrônoma.
O trabalho comprovou também que ambos os sexos do inseto têm a capacidade de transmitir a proteína Bt aos descendentes. “Quando ambos os pais foram expostos à proteína, a concentração de Cry1F sequestrada nos ovos foi significativamente maior (quase o dobro) em relação a quando apenas o macho ou a fêmea foram expostos à proteína”, enfatiza Souza.
Importância da área de refúgio é comprovada cientificamente
Indivíduos em destaque na cor vermelha: lagartas resistentes à proteína Bt. Na cor azul, suscetíveis
Foram avaliadas populações de lagartas resistentes à proteína Cry1F com ambos os sexos expostos à mesma proteína; lagartas resistentes com apenas o macho exposto à Cry1F; lagartas resistentes com apenas a fêmea exposta; e lagartas suscetíveis não expostas à proteína que serviram como tratamento-controle. Todas as populações avaliadas – resistentes e suscetíveis – foram expostas à proteína no final da fase de desenvolvimento larval. A quantificação da proteína Cry1F nos ovos foi realizada no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, em Brasília (DF).
Os resultados mostram que houve diferença significativa em relação à sobrevivência larval quando lagartas resistentes e suscetíveis foram expostas à proteína Cry1F. “Obviamente, a população suscetível apresentou 100% de mortalidade. Contudo, entre as lagartas resistentes, a sobrevivência variou entre 85% e 90%, em média, sendo que os insetos completaram o ciclo de desenvolvimento. Esses resultados mostram que a característica de resistência entre a população resistente foi mantida e que a população suscetível continuou sendo controlada pela proteína Cry1F. Foi verificado também que essa proteína não teve efeito prejudicial na reprodução e longevidade”, explica Camila Souza.
“Nossos resultados contribuem para o entendimento da evolução da resistência e reforçam a importância do uso adequado de áreas de refúgio (veja acima figuras que ilustram a pressão de seleção), uma vez que, quando ambos os sexos resistentes são expostos à proteína, o sequestro e a transferência para os ovos são potencializados”, cita a autora. Refúgio é uma área, dentro da lavoura, onde se planta o milho sem a tecnologia Bt. Seu papel é reduzir a exposição dos insetos-praga ao mecanismo de ação dos transgênicos. Os insetos que nascem na área de refúgio continuam suscetíveis à toxina transgênica e podem se acasalar com os resistentes e, assim, diluir a população de indivíduos que desenvolveram resistência.
“Se imaginarmos a existência das áreas de refúgio em proporção adequada, haveria maior possibilidade de somente um dos pais ser exposto à proteína, reduzindo a exposição embrionária. Além disso, o acasalamento com os indivíduos suscetíveis vindos da área de refúgio teria papel fundamental na redução da exposição dos embriões à proteína de forma prematura. As implicações que esses processos podem ter na evolução da resistência a insetos e no manejo de culturas Bt permanecem desconhecidas, e as consequências da transferência de proteínas Bt precisam ser estudadas”, destaca a pesquisadora.
Como funciona o Bt
Um dos principais problemas surgidos após a ampla adoção do milho Bt foi a seleção de insetos-alvo resistentes às proteínas tóxicas que até então controlavam as principais pragas da cultura, como a lagarta-do-cartucho. O milho Btexpressa uma ou mais proteínas da bactéria Bacillus thuringiensis, que possuem atividade inseticida contra os insetos-alvo.
No Brasil, o primeiro evento de milho transgênico foi liberado para uso comercial pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio) em 2008. “Nesses dez anos de utilização da tecnologia transgênica em milho, houve grandes transformações do manejo de praga da cultura”, avalia a pesquisadora Simone Martins Mendes.
Segundo dados de agosto de 2018, da Consultoria Céleres, publicados no documento “20 anos da adoção da biotecnologia agrícola no Brasil: lições aprendidas e novos desafios”, a área plantada com cultivares de milho geneticamente modificado atingiu 107,3 milhões de hectares na última safra, considerando o acumulado entre as safras de verão e de inverno. “A velocidade de adoção do milho transgênico ultrapassou o patamar de 90% da área total da safra de inverno, em apenas dez temporadas de liberação comercial”, informa a consultoria.
“O risco potencial para a evolução da resistência é alto para a lagarta-do-cartucho porque o sistema de produção no Brasil tem sobreposição temporal e espacial do milho Bt. No campo, essas culturas estão expostas à população de Spodoptera frugiperda, sendo que a pressão de seleção é intensa em cada geração da praga, aumentando o risco de seleção de indivíduos resistentes”, diz a agrônoma Camila Fernandes.
Segundo a engenheira-agrônoma, para prolongar a eficácia de culturas Bt é essencial desenvolver uma gestão estratégica para atrasar a evolução da resistência de pragas aos transgênicos. Uma das principais estratégias apontada pela pesquisa é a utilização da chamada alta dose (elevada expressão, nas cultivares, da proteína Bt) juntamente com a adoção da área de refúgio, impedindo a evolução da resistência. Outro método para o manejo da resistência é a introdução de eventos transgênicos piramidados, ou seja, a combinação de diferentes genes em um só híbrido provendo controle independente contra a mesma praga. As proteínas Vip3a20, por exemplo, possuem características importantes como a resistência a insetos em que a proteína Cry já não faz mais efeito.
“Em outro 
Um dos principais problemas surgidos após a ampla adoção do milho Bt foi a seleção de insetos-alvo resistentes às proteínas tóxicas que até então controlavam as principais pragas da cultura, como a lagarta-do-cartucho. O milho Btexpressa uma ou mais proteínas da bactéria Bacillus thuringiensis, que possuem atividade inseticida contra os insetos-alvo.